Síntesis de oligosacáridos de ácido hialurónico y sulfato de condroitina y evaluación de sus interacciones con proteínas por polarización de fluorescencia

Los Glicosaminoglicanos o GAGs, una de las clases más importantes de moléculas extracelulares, son cadenas polisacarídicas lineales. Están formados por unidades disacarídicas repetitivas que consisten, en líneas generales, en un ácido urónico (ácido ¿-L-idurónico o ácido ß-D-glucurónico) unido a través de un enlace (1¿3) ó (1¿4) a un amino azúcar (N-acetil glucosamina o N-acetil galactosamina). Podemos catalogar los GAGs en cuatro grandes familias: la primera constituida por el sulfato de heparano (HS) y la heparina; una segunda, a la que pertenecen el sulfato de condroitina (CS) y el sulfato de dermatano (DS); el sulfato de queratano (KS) y, finalmente, el ácido hialurónico (HA). La gran complejidad estructural de los GAGs y, en consecuencia, la elevada densidad de información que éstos contienen derivan de su biosíntesis. Una de las consecuencias de la inmensa diversidad estructural de los GAGs es que estas moléculas son capaces de unirse e interactuar con una amplia variedad de proteínas, tales como factores de crecimiento, quimiocinas, morfógenos y enzimas. En esta Tesis Doctoral se han desarrollado estrategias sintéticas para la preparación de oligosacáridos de ácido hialurónico y de sulfato de condroitina. Las limitaciones que se pueden encontrar en el aislamiento de estas biomoléculas de fuentes naturales hacen que la síntesis química de GAGs se presente como una alternativa muy interesante, mediante la cual se puede preparar prácticamente cualquier glicosaminoglicano con un elevado control en la estereoquímica, el tamaño y el patrón de sulfatación. La obtención de estructuras bien definidas facilita la identificación de secuencias biológicamente activas y la obtención de relaciones estructura-actividad, lo cual permite analizar el potencial terapéutico de los glicosaminoglicanos, en áreas como la biología del cáncer, la neurobiología y la virología. OBJETIVOS 1. Preparación de oligosacáridos de ácido hialurónico para el estudio, a nivel molecular, de sus interacciones con proteínas, como langerina y CD44, mediante experimentos de RMN. 2. Evaluación el uso de etiquetas perfluoradas para facilitar las purificaciones de los intermedios de reacción. 3. Desarrollo de una nueva ruta sintética para la obtención de oligosacáridos de sulfato de condroitina, usando nuevos bloques monosacarídicos de N-acetil galactosamina, protegidos con un grupo N-trifluoroacetilo. 4. Puesta a punto de experimentos basados en medidas de fluorescencia para evaluar la interacción de los oligosacáridos GAG sintetizados con determinadas proteínas. METODOLOGÍA Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS El desarrollo de una estrategia sintética en la que se usan directamente bloques de ácido glucurónico en las reacciones de glicosidación ha permitido la preparación de oligosacáridos de ácido hialurónico. Con el objetivo de optimizar la primera aproximación sintética, se estudió el uso de unidades monosacarídicas parcialmente benciladas, más reactivas, incrementando así los rendimientos de las glicosidaciones y minimizando la formación de productos secundarios. La eficiencia de esta estrategia se ha demostrado con la síntesis total de fragmentos de ácido hialurónico de tamaño di-, tri- y tetrasacarídico. Estos productos finales han resultado ser unos ligandos excelentes para estudiar, a nivel molecular, las interacciones entre el ácido hialurónico y determinados receptores proteicos, como la langerina, mediante técnicas de RMN y modelización molecular. En paralelo, se ha abordado la síntesis de un fragmento trisacarídico de ácido hialurónico asistida por etiquetas perfluoradas. Esta metodología nos permitió la purificación de los intermedios de reacción mediante extracción sólida utilizando una sílica gel perfluorada, evitando así las dificultades inherentes a la realización de múltiples purificaciones cromatográficas características de la síntesis de oligosacáridos clásica. En el diseño de una estrategia sintética para la obtención de oligosacáridos de sulfato de condroitina, se estudió el uso de unidades de galactosamina en las que la función amino se ha protegido temporalmente con un grupo trifluoroacetilo. Este patrón de grupos protectores ha resultado ser eficaz para la preparación de oligómeros con buen rendimiento. El grupo trifluoroacetilo condujo a la formación selectiva de los 1,2-trans glicósidos deseados y, al mismo tiempo, pudo ser fácilmente desprotegido al final de la secuencia sintética para generar los productos finales N-acetilados. La compatibilidad del diseño sintético desarrollado con las etapas finales de desprotección/sulfatación se demostró con la preparación de un tetrasacárido heptasulfatado. Utilizando los oligosacáridos sintetizados en esta Tesis Doctoral y en nuestro grupo de investigación, se han desarrollado experimentos basados en medidas de fluorescencia para la evaluación de las interacciones entre oligómeros sintéticos de tipo glicosaminoglicano y las correspondientes proteínas. En una primera aproximación, oligosacáridos sintéticos de heparina se inmovilizaron de forma covalente a los pocillos de una microplaca convenientemente funcionalizada. Para la detección de la proteína enlazada se emplearon los correspondientes anticuerpos. De esta manera, se pudieron determinar las constantes de disociación relativas para la interacción carbohidrato-proteína. Por otro lado, se ha desarrollado también un experimento de polarización de fluorescencia que permitió estimar las afinidades relativas de los oligosacáridos sintéticos en solución, sin necesidad de funcionalizarlos para tal fin, ni unirlos a una superficie sólida, lo que supone una gran ventaja. A través de este ensayo de competición se pudieron analizar y comparar, rápidamente, las actividades de un gran número de compuestos, utilizando una cantidad mínima de muestra

Chondroitin Sulfate Tetrasaccharides: Synthesis, Three-Dimensional Structure and Interaction with Midkine

The biological activity of midkine, a cytokine implicated in neuro- and tumourigenesis, is regulated by its binding to glycosaminoglycans (GAGs), such as heparin and chondroitin sulfate (CS). To better understand the molecular recognition of GAG sequences by this growth factor, the interactions between synthetic chondroitin sulfate-like tetrasaccharides and midkine were studied by using different techniques. Firstly, a synthetic approach for the preparation of CS-like oligosaccharides in the sequence GalNAc-GlcA was developed. A fluorescence polarisation competition assay was then employed to analyse the relative binding affinities of the synthetic compounds and revealed that midkine interacted with CS-like tetrasaccharides in the micromolar range. The 3D structure of these tetramers was studied in detail by a combination of NMR spectroscopy experiments and molecular dynamics simulations. Saturation transfer difference (STD) NMR spectroscopy experiments indicate that the CS tetrasaccharides bind to midkine in an extended conformation, with similar saturation effects along the entire sugar chain. These results are compatible with docking studies that suggest an interaction of the tetrasaccharide with midkine in a folded structure. Overall, this study provides valuable information on the interaction between midkine and well-defined, chemically synthesised CS oligosaccharides and these data can be useful for the design of more active compounds that modulate the biological function of this protein.Peer Reviewe

Predicting respiratory failure in patients infected by SARS-CoV-2 by admission sex-specific biomarkers

Background: Several biomarkers have been identified to predict the outcome of COVID-19 severity, but few data are available regarding sex differences in their predictive role. Aim of this study was to identify sex-specific biomarkers of severity and progression of acute respiratory distress syndrome (ARDS) in COVID-19. Methods: Plasma levels of sex hormones (testosterone and 17β-estradiol), sex-hormone dependent circulating molecules (ACE2 and Angiotensin1-7) and other known biomarkers for COVID-19 severity were measured in male and female COVID-19 patients at admission to hospital. The association of plasma biomarker levels with ARDS severity at admission and with the occurrence of respiratory deterioration during hospitalization was analysed in aggregated and sex disaggregated form. Results: Our data show that some biomarkers could be predictive both for males and female patients and others only for one sex. Angiotensin1-7 plasma levels and neutrophil count predicted the outcome of ARDS only in females, whereas testosterone plasma levels and lymphocytes counts only in males. Conclusions: Sex is a biological variable affecting the choice of the correct biomarker that might predict worsening of COVID-19 to severe respiratory failure. The definition of sex specific biomarkers can be useful to alert patients to be safely discharged versus those who need respiratory monitoring

Disease-specific and general health-related quality of life in newly diagnosed prostate cancer patients: The Pros-IT CNR study

Background: The National Research Council (CNR) prostate cancer monitoring project in Italy (Pros-IT CNR) is an observational, prospective, ongoing, multicentre study aiming to monitor a sample of Italian males diagnosed as new cases of prostate cancer. The present study aims to present data on the quality of life at time prostate cancer is diagnosed. Methods: One thousand seven hundred five patients were enrolled. Quality of life is evaluated at the time cancer was diagnosed and at subsequent assessments via the Italian version of the University of California Los Angeles-Prostate Cancer Index (UCLA-PCI) and the Short Form Health Survey (SF-12). Results: At diagnosis, lower scores on the physical component of the SF-12 were associated to older ages, obesity and the presence of 3+ moderate/severe comorbidities. Lower scores on the mental component were associated to younger ages, the presence of 3+ moderate/severe comorbidities and a T-score higher than one. Urinary and bowel functions according to UCLA-PCI were generally good. Almost 5% of the sample reported using at least one safety pad daily to control urinary loss; less than 3% reported moderate/severe problems attributable to bowel functions, and sexual function was a moderate/severe problem for 26.7%. Diabetes, 3+ moderate/severe comorbidities, T2 or T3-T4 categories and a Gleason score of eight or more were significantly associated with lower sexual function scores at diagnosis. Conclusions: Data collected by the Pros-IT CNR study have clarified the baseline status of newly diagnosed prostate cancer patients. A comprehensive assessment of quality of life will allow to objectively evaluate outcomes of different profile of care

Synthesis of hyaluronic acid oligosaccharides and exploration of a fluorous-assisted approach

The synthesis of hyaluronic acid oligomers (tri- and tetrasaccharide) is described. We have followed a pre-glycosylation oxidation strategy. Glucuronic acid units were directly employed in coupling reactions with suitably protected glucosamine derivatives. In order to simplify the purification of synthetic intermediates, a fluorous-assisted strategy has been also explored. Using this approach, a hyaluronic acid trisaccharide was prepared.Peer reviewe

Modelli ecoidrologici per la descrizione dei flussi energetici, di CO2 e di dinamica della vegetazione in ambiente mediterraneo

Dottorato di Ricerca Ingegneria Idraulica per l'Ambiente e il Territorio, Ciclo XXII, a.a. 2009Unuiversità della Calabri

Sviluppo di un modello eco-idrologico completo: criteri per la convergenza ed applicazione al caso biosphere

Dottorato di Ricerca in Ingegneria Idraulica per l'Ambiente e il Territorio Ciclo XXVII, a.a. 2014Università della Calabri

Ottimizzazione della gestione di sistemi multi-invaso a scopo plurimo: il caso del sistema Ariamacina-Cecita-Muone

Dottorato di Ricerca Ingegneria Idraulica per l'Ambiente e il Territorio Ciclo XXII, a.a.2010Università della Calabri

Contributo alla riossigenazione naturale della zona eufotica dei corpi idrici dovuto all'attività fotosintetica

Dottorato di Ricerca in Igegneria Idraulica per l'Ambiente ed il Territorio, Ciclo XXII, a.a.2010Università della Calabri